斑馬魚(yú)胚胎顯微注射實(shí)驗(yàn)操作方法

顯微注射技術(shù)是在顯微鏡下，利用顯微操作系統(tǒng)，控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)，對(duì)進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。該技術(shù)已經(jīng)在越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)生物學(xué)研究領(lǐng)域中成為一項(xiàng)普遍的操作技術(shù)，并成功運(yùn)用于包括小鼠、大鼠、兔子、斑馬魚(yú)及許多大型家畜，如牛、羊、豬等動(dòng)物中。

斑馬魚(yú)顯微注射是將實(shí)驗(yàn)材料直接注射到1-4細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎中，由于在這個(gè)胚胎發(fā)育早期沒(méi)有膜分隔細(xì)胞和卵黃，注入1個(gè)細(xì)胞或卵黃的溶液將擴(kuò)散到整個(gè)胚胎中。通過(guò)注射不同類型的實(shí)驗(yàn)樣品，實(shí)現(xiàn)基因的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)（over-expression）、表達(dá)敲減（knock-down）、以及制備轉(zhuǎn)基因或突變斑馬魚(yú)品系等研究。

一、   胚胎顯微注射技術(shù)的應(yīng)用

斑馬魚(yú)作為一種新興的理想的模式生物，在生命科學(xué)研究中已得到廣泛應(yīng)用，斑馬魚(yú)胚胎顯微注射技術(shù)是這些應(yīng)用研究的基礎(chǔ)技術(shù)平臺(tái)之一。通過(guò)顯微注射不同的實(shí)驗(yàn)樣品，可以實(shí)現(xiàn)以下不同的目的。

（一）可以通過(guò)注射體外合成的mRNA實(shí)現(xiàn)目的基因的過(guò)表達(dá)，并通過(guò)觀察表型推測(cè)目的基因的功能。

（二）可以通過(guò)注射反義嗎啉環(huán)寡核苷酸（morpholino）敲減目的基因的表達(dá)。morpholino是穩(wěn)定的人工合成的核酸類似物，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的堿基互補(bǔ)配對(duì)與mRNA結(jié)合，阻斷蛋白翻譯或mRNA剪切。與過(guò)表達(dá)相反，這種方法導(dǎo)致mRNA蛋白產(chǎn)物減少，可以通過(guò)該蛋白減少時(shí)對(duì)生物學(xué)過(guò)程的改變來(lái)解釋目的基因在發(fā)育中所扮演的角色。

（三）基因敲除（knock-out）品系的研制?；蚯贸废凳窃诨铙w動(dòng)物上開(kāi)展基因功能研究的重要工具。CRISPR-Cas9技術(shù)是一種高效、快速的構(gòu)建敲除品系的新方法。這個(gè)技術(shù)的原理是通過(guò)人工設(shè)計(jì)出sgRNA，sgRNA能夠通過(guò)堿基配對(duì)識(shí)別目標(biāo)序列，然后引導(dǎo)體外合成的核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白在目標(biāo)靶點(diǎn)產(chǎn)生切割。DNA斷裂后，細(xì)胞將通過(guò)非同源末端接合(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來(lái)進(jìn)行修復(fù)，將斷裂的DNA重新連接起來(lái)，在這個(gè)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生DNA堿基的插入或缺失的錯(cuò)誤，從而引起DNA突變。

（四）轉(zhuǎn)基因品系的研制。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過(guò)的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀產(chǎn)生可遺傳的修飾。在轉(zhuǎn)基因品系研制中，轉(zhuǎn)基因載體是承載外源基因，攜帶靶基因進(jìn)入斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞，并將目的基因整合到斑馬魚(yú)基因組使其穩(wěn)定維持的DNA分子。顯微注射是制備轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)過(guò)程中常用的方法。

二、 顯微注射系統(tǒng)的搭建

斑馬魚(yú)顯微注射需有一套相當(dāng)精密的顯微操作設(shè)備，主要包括以下幾種（圖4.1）：

圖4.1顯微注射常用設(shè)備。A: SUTTERP-1000微電極拉制儀; B: ASI顯微注射儀MPPI-3;

C: 持針器和顯微操作儀MM33; D：體視顯微鏡

微電極拉制儀用于拉制毛細(xì)管成注射針，可以調(diào)節(jié)的溫度、拉力、拉制時(shí)間等參數(shù)拉制出合適針尖的注射針，為了防止空氣中灰塵顆粒沾染注射針引起針尖阻塞，注射針現(xiàn)用現(xiàn)拉。

顯微注射儀用于注射針內(nèi)的溶液施加壓力脈沖，利用可調(diào)節(jié)氣壓脈沖將精準(zhǔn)體積的樣品注射至胚胎體內(nèi)。注射器還和一個(gè)腳踏板相連，使得實(shí)驗(yàn)人員在使用雙手的同時(shí)還可以激活壓力脈沖將實(shí)驗(yàn)材料注射入胚胎中；

持針器用于固定在注射過(guò)程中使用的注射針，并將它與注射器的空氣管相連，常裝在顯微操作器上；

顯微操作儀用于注射針的顯微操縱，可以在顯微注射過(guò)程中對(duì)注射針的位置進(jìn)行細(xì)小和精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)；

體視顯微鏡用于顯微注射時(shí)觀察胚胎，可以在顯微注射過(guò)程中看到胚胎并對(duì)注射針?biāo)诘奈恢镁劢埂?/span>

三、 顯微注射過(guò)程及注意事項(xiàng)

顯微注射技術(shù)是一個(gè)相對(duì)精細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作，主要有以下步驟。

（一）準(zhǔn)備注射用的胚胎

注射的前1DAY，按照雌:雄為1:1或2 :1的比例將成年斑馬魚(yú)放置于配種缸，用隔板分開(kāi)（圖2.3）。

注射的早上，抽去隔板，雌雄魚(yú)開(kāi)始交配。一般在十多分鐘左右親魚(yú)產(chǎn)卵并使卵受精。一般一次抽板2缸魚(yú)左右，隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度適時(shí)給其它缸抽板?？稍诔榘迩跋葘?nèi)缸連同親魚(yú)換到另一干凈外缸中以節(jié)約清潔胚胎的時(shí)間。

親魚(yú)產(chǎn)卵后，取180μm孔徑的過(guò)濾網(wǎng)，收集外缸底部的魚(yú)卵，并用養(yǎng)殖水清洗魚(yú)卵2-3次。應(yīng)盡量收集20 min內(nèi)的受精卵（即對(duì)于同一缸親魚(yú)，兩次收集受精卵的時(shí)間間隔不得超過(guò)20分鐘，以保證發(fā)育階段的一致性）。受精卵分選和洗凈后，用吸管將收集的卵置于平板培養(yǎng)皿中，去除平皿內(nèi)的異物和胚胎周?chē)乃?，采用干法注射?/span>

胚胎在受精后10分鐘卵膜將膨脹，隨后數(shù)分鐘內(nèi)細(xì)胞形態(tài)變得較為規(guī)整（容易找到動(dòng)物極），此時(shí)可以開(kāi)始注射。受精后45分鐘左右（標(biāo)準(zhǔn)培育溫度下所需時(shí)間，具體情況同室溫有關(guān)）發(fā)生一次卵裂。樣品通常需要注射到1-4細(xì)胞時(shí)期胚胎，以下上樣、斷針、定量和注射都要在此段時(shí)間內(nèi)或在此之前完成。

（二）拉針、上樣和儀器準(zhǔn)備工作

1、拉針。使用微電極拉制儀拉制一定數(shù)量的毛細(xì)管，應(yīng)提前準(zhǔn)備。

2、可以提前準(zhǔn)備，樣品通常包括質(zhì)粒DNA、RNA、morpholino等。

DNA質(zhì)粒樣品：質(zhì)粒DNA需使用“去內(nèi)毒。素"的試劑盒提取。一般注射量為每枚胚胎20-150pg，多于200pg胚胎死亡率上升。

mRNA樣品：一般注射量為每枚胚胎10-500pg，針對(duì)不同的mRNA樣品，需要摸索各自適宜的濃度。

Morpholino樣品：參見(jiàn)GeneTools公司隨樣品提供的說(shuō)明書(shū)。通常產(chǎn)品總量為300nmol一瓶，約相當(dāng)于2400μg，加入200μL滅過(guò)菌的去離子水（電阻率>18MΩ/cm）稀釋至12μg/μL，每管20μL分裝作為儲(chǔ)液凍存在－20℃。注射時(shí)取一管稀釋至0.5-6μg/μL (ng/nL)左右。針對(duì)不同的morpholino，需摸索各自合適的濃度，以獲得理想的表型而不產(chǎn)生毒性效應(yīng)為宜。在使用新的morpholino時(shí)，必須慎重考量該morpholino的有效性和特異性。

所有樣品使用前需要先離心，使可能存在的固體懸浮物沉淀到管底，避免堵住針頭。一般可以在注射樣品中加入終濃度10%-20%的酚紅，便于觀察注射過(guò)程。

3、上樣裝針。將拉制好的毛細(xì)管豎直固定。然后吸取1-3μl顯微注射液，逐滴地將注射液滴在毛細(xì)管頂端，在毛細(xì)管內(nèi)芯引導(dǎo)下，液體通過(guò)虹吸作用將匯聚于玻璃管針頭部分。如果使用的毛細(xì)管沒(méi)有內(nèi)芯，可以使用微量上樣移液槍頭上樣。上樣體積至少為1μL，一定不要在針內(nèi)引入空氣柱，否則會(huì)難以控制注射量。

4、打開(kāi)顯微注射儀。以MPPI-3脈沖壓力注射儀為例。打開(kāi)氮?dú)夤蘅傞y，調(diào)節(jié)壓力至0-0.5之間。打開(kāi)注射儀開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)主操作面板上的壓力值為10-20左右，選擇合適的注射壓力和脈沖時(shí)間。（圖4.2）

圖4.2 全套搭建好的顯微注射設(shè)備（左側(cè)）和破針操作（右側(cè)）

（三）注射斑馬魚(yú)胚胎

1、破針。將上好樣品的注射針插入持針器中固定，然后在體視鏡高倍放大率下，用尖頭鑷子將注射針的前端夾斷。（圖4.2）

2、注射劑量調(diào)整。把臺(tái)微尺放置到體視顯微鏡下，加入一滴礦物油，將注射針伸入礦物油中，踩動(dòng)踏板壓將一滴注射液送到礦物油，測(cè)量注射樣品的大小。注射體積與針尖大小、注射壓力、注射時(shí)間、溶液粘度和外部壓力有關(guān)，理想的注射劑量為胚胎體積的10%，一般為1nL（注射樣品的直徑在10個(gè)小格左右）。注射劑量過(guò)大體積會(huì)損傷胚胎，過(guò)小可能影響定量精準(zhǔn)度和擴(kuò)散的均勻程度。

3、注射。將收集的胚胎放置到體視顯微鏡鏡下，用低倍物鏡對(duì)準(zhǔn)胚胎調(diào)焦，輕輕的落下針尖，并將注射針尖推入視野中心，通過(guò)微操作系統(tǒng)的微調(diào)調(diào)整注射針位置，直到清晰見(jiàn)到針尖為止。進(jìn)一步調(diào)整顯微鏡焦距和注射針及胚胎的位置，使胚胎和注射針尖均達(dá)到非常清晰程度。推動(dòng)操縱桿，小心進(jìn)針，使注射針針尖進(jìn)入胚胎。腳踏開(kāi)關(guān)將樣品注入胚胎。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，先關(guān)閉氮?dú)夤蘅傞y（逆時(shí)針變松為關(guān)），排空儀器中的氣體后，關(guān)閉總開(kāi)關(guān)。

（四）注射胚胎的培養(yǎng)和觀察

1、胚胎養(yǎng)殖。注射結(jié)束后，將胚胎轉(zhuǎn)移至養(yǎng)殖水中，置入28?C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待胚胎發(fā)育2小時(shí)后，顯微鏡下挑出未受精的胚胎和死亡的胚胎。孵化期間每天要及時(shí)去除敗育胚胎，勤換水。

2、胚胎麻醉和固定。麻醉劑可以使魚(yú)類代謝減緩，鰓動(dòng)頻率下降，氧的需求量減少，從而方便進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。通常將斑馬魚(yú)浸泡于0.016%的Tricaine中進(jìn)行麻醉。待胚胎麻醉后，利用4%的甲基纖維素固定胚胎，將胚胎調(diào)整到合適的位置。廢棄的顯微注射針的尖兒端燒溶后可以用于調(diào)整胚胎。

3、胚胎觀察。為了便于觀察顯微注射的結(jié)果，本次培訓(xùn)使用質(zhì)粒pT2(tpma:EGFP)和chordin mopholino作為注射練習(xí)的材料。質(zhì)粒pT2(tpma:EGFP)注射后，胚胎發(fā)育至1天時(shí)，在肌肉中特異表達(dá)綠色熒光蛋白；chordin mopholino注射后的胚胎出現(xiàn)腹部化（ventralization）。（圖4.3）

圖4.3 顯微注射后24hpf胚胎的照片。胚胎發(fā)育至1天時(shí)，注射質(zhì)粒pT2(tpma:EGFP)的胚胎在肌肉細(xì)胞中特異表達(dá)綠色熒光蛋白（A）；注射chordin mopholino的胚胎產(chǎn)生腹部化表型（B）。

顯微注射的注意事項(xiàng)

顯微注射的操作過(guò)程中有許多細(xì)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)的成功率，需要特別關(guān)注，主要包括以下幾方面。

1、注射樣品的質(zhì)量和和濃度。顯微注射的樣品種類繁多，包括mRNA、DNA或蛋白質(zhì)等，但是注射樣品是否純凈是關(guān)系到注射效率高低的重要因素之一。此外，注射樣品的濃度不易太高，例如注射DNA的總濃度一般控制在200pg以下。

2、注射前小心將顯微注射針定位，注射針定位到卵表面的注射角度是穿透堅(jiān)硬的卵殼注射成功的關(guān)鍵。

3、破針時(shí)，將針尖一點(diǎn)點(diǎn)剪斷，不宜一次剪太多。顯微注射針尖如果太粗，會(huì)導(dǎo)致DNA流量過(guò)多，受精卵易于裂解；太細(xì)則導(dǎo)致針內(nèi)DNA流出速率過(guò)慢，且易堵塞針尖，而使DNA無(wú)法順利流入，影響注射效率。因此進(jìn)行顯微注射時(shí)，如何制備適用的顯微注射針是顯微注射效率極其重要的因素。

4、在注射過(guò)程中，常發(fā)生注射針堵塞，堵塞后，通常可通過(guò)輕夾針尖、增大輸出壓力或按pulse/CONT開(kāi)關(guān)而得以緩解。如果不能解決，換用新的注射針。

5、注射時(shí)注射器的壓力不宜變化太快，否則會(huì)造成注射量操作難以控制，導(dǎo)致胚胎內(nèi)環(huán)境改變過(guò)快過(guò)大甚至脹破細(xì)胞。氮?dú)夤薜膲毫﹂y顯示氣體的壓力，壓力為0表明罐內(nèi)無(wú)氣體，需要及時(shí)換氣。

6、注射完畢，慢慢抽出注射針，要一氣呵成，避免受精卵內(nèi)物質(zhì)隨著毛細(xì)針抽出，造成受精卵的損傷。

7、在整個(gè)過(guò)程中，嚴(yán)禁將注射針尖對(duì)著人員和儀器，因?yàn)樽⑸溽樤诔轴樒魃习惭b不牢時(shí)或針尖堵塞，注射器、管子及注射針內(nèi)的壓力，可能將注射針射出傷人。